如何设计引物(诺唯赞上如何设计引物)

如何设计引物，诺唯赞上如何设计引物？

引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在耐高温DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。

pcr反应五大体系？

PCR反应体系：

1. 缓冲液

标准的缓冲液含 1pmol/ml Tris ·HCl，其 pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+。

2.dNTP

脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 等在内的统称，即合成新的 DNA 链的材料。4 种 dNTP 的浓度相等，总浓度一般为 200pmol/ml （即饱和浓度）。dNTP 可与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度下降，影响 DNA 聚合酶的活性。

3. 引物

引物是一段短的单链 DNA 片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA 聚合酶可由其 3′端开始合成新的核酸链。引物长度一般以 18～30bp 为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。

4. 模板

模板是一段单链或者双链 DNA，提供用于进行 PCR 扩增的原始信息。对模板的纯度要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白等。模板 DNA 应该尽量保持低温保存。

5.Taq DNA 聚合酶

Taq DNA 聚合酶以 DNA 为复制模板，从将 DNA 由 5' 端点开始复制到 3' 端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成（在具备模板、引物、dNTP 等的情况下）及其相辅的活性。必须一直保存于－20℃，内含甘油保存。最适反应温度 72 ℃，即延伸温度。通常在配制 PCR 体系的最后加入。

什么是上游引物和下游引物？

引物（Primer）在聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。

自然中存在有生物的DNA复制引物（RNA引物）和聚合酶链式反应（PCR）中人工合成的引物（通常为DNA引物）。一般所说引物，指DNA引物，以下简称引物。

上游引物：DNA分子两端不一样，因为核苷酸分子不是对称的，5'位有个磷酸，3'位是-OH就是：磷酸端和羟基端。DNA复制总是从5’端到3’端，因为DNA聚合酶只能往3’端加核苷酸。所以谁先复制谁上游，往后的就是下游，上游下游是个相对概念，是某一个序列/碱基相对于另一个序列/碱基而言。上游引物是靠近5'端的，下游引物是靠近3‘端的。

DNA是双链，两个链是反向平行的，DNA聚合酶顺着其中一个链走，这个链就是负链，另一个链是反着一段一段复制的，这个是正链。

同源重组引物怎么设计策略？

同源重组的基因克隆方法， 相比双酶切载体构建方法，该方法的构建过程有些不同。首先，靶基因片段扩增引物有别于常规引物设计；

其次，载体切割过程中只需要进行单酶切；

第三，载体和目的基因片段的连接是基于同源重组而不是粘性末端互补。

如何在引物两端加入酶切位点？

设计引物时在2引物的5‘端添加酶切位点和保护碱基，保护碱基根据限制性内切酶的不同而不同，可查资料选择。